Медицинская загадка поставила вас в тупик? Попробуйте метагеномику

В 2019 году у Николь Кано, до того совершенно здоровой матери троих детей из Фресно, штат Калифорния, начались все более сильные головные боли. Раньше она ими не страдала; по всей видимости, боли появились после операции по липосакции, которую Кано сделала в Тихуане, в Мексике. Сначала она обратилась к своему лечащему врачу, а затем к неврологу, который диагностировал у нее мигрень. Ей назначили стандартное лечение — укол и таблетки, — но боль только усилилась. «Было такое чувство, будто мой череп сдавливают, а глаза вот-вот выскочат из орбит», — рассказала она. Кано обратилась в местное отделение неотложной помощи, где ее снова лечили от мигрени, после чего отправили домой. Несколько недель спустя муж Кано, Хавьер, находился на работе — он руководил производственным складом, — когда получил от нее бессвязное голосовое сообщение. Она была дома одна и не понимала, что происходит. В конце концов приехала скорая помощь и срочно доставила ее в больницу.

На этот раз врачи отделения неотложной помощи провели люмбальную пункцию: ввели иглу в спину, чтобы взять образец спинномозговой жидкости. Кано вспоминает, как врачи сказали ей, что давление открытия, то есть показатель того, с какой силой жидкость давит на мозг, оказалось самым высоким из всех, что им когда-либо доводилось видеть. Результат убедительно указывал на менингит: воспаление оболочек головного и спинного мозга, которое часто вызывают бактерии, вирусы или другие патогены, однако целая серия анализов не выявила никакой инфекции. Врачи предположили, что причиной может быть грибок, но не хотели назначать ей потенциально токсичные противогрибковые препараты, не подтвердив свою догадку. «Они говорили, что больше ничего не могут сделать», — рассказала Кано.

Один из врачей, лечивших Кано, слышал о новом и мощном методе генетического тестирования — метагеномике, которая позволяет за один раз искать тысячи различных микроорганизмов. Врач связался с Майклом Уилсоном, одним из ведущих специалистов в области метагеномики, который занимается нейроинфекционными заболеваниями в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Через неделю Кано уже сидела в кабинете Уилсона и рассказывала о своих мучениях. Он распорядился госпитализировать ее в клинику университета. «Мы во всем разберемся, и с вами все будет хорошо», — сказал он ей.

Обычный процесс диагностики редкой инфекции можно сравнить с попыткой определить, из какой книги выпала найденная в библиотеке страница. На странице обязательно будут подсказки: возможно, ее содержание укажет на конкретную полку, а характерные обороты речи помогут узнать автора. Но иногда соответствие так и не удается найти. Диагностические тесты существуют для множества заболеваний, однако список возможных диагнозов у врача может быть длинным, а возбудитель настолько редким, что он просто не придет в голову. Метагеномика, напротив, больше похожа на поиск по всей базе Google Books. Сначала ученые секвенируют весь генетический материал, содержащийся в образце пациента. Затем сравнивают найденное с огромным массивом данных об известных патогенах. Совпадения позволяют выявить инфекции, которые врачи либо не смогли вырастить в лабораторной культуре, либо вообще не догадались искать.

В Калифорнийском университете Кано сделали еще одну люмбальную пункцию, пока Уилсон пытался установить причину ее головных болей. Его коллеги секвенировали весь генетический материал, который удалось обнаружить в спинномозговой жидкости, и проверили его по своей генетической библиотеке патогенов. Наконец метагеномика выявила совпадение: Candida parapsilosis — дрожжевой грибок, который обычно живет на нашей коже, не причиняя вреда. «Дрожжевому грибку совершенно нечего было делать в ее спинномозговой жидкости», — сказал Уилсон. Особое внимание он обратил на один факт из истории болезни Кано: перед липосакцией в Тихуане ей сделали эпидуральную анестезию, введя препарат рядом со спинным мозгом. Теперь Уилсон предполагает, что препарат был заражен.

Когда Кано наконец узнала, что стало причиной ее болезни, она расплакалась. Лечение грибковой инфекции оказалось мучительным: ей назначили два сильнодействующих противогрибковых препарата, один из которых вызывал яркие галлюцинации, а для снижения давления на мозг пришлось установить в голове шунт. Семь лет спустя шунт по-прежнему остается на месте, и лишь недавно Кано перестала принимать противогрибковые лекарства. И все же, сказала она журналисту The New Yorker, «мое тело становится сильнее, и я знаю, что со мной все будет хорошо».

Инфекционные микроорганизмы преследовали человечество задолго до того, как люди научились их видеть и понимать. В конце XVII века нидерландский ученый-самоучка Антони ван Левенгук с помощью собственноручно изготовленного микроскопа обнаружил в дождевой воде то, что назвал «анималькулями», — крошечные живые организмы. Два столетия спустя Луи Пастер и Роберт Кох помогли утвердить микробную теорию, согласно которой многие заболевания вызываются инфекционными агентами, размножающимися в организме. Кох разработал способ выращивания бактерий в неглубокой стеклянной чашке, а Юлиус Петри усовершенствовал ее, добавив плотно прилегающую крышку. Теперь врачи могли выращивать в лабораторных культурах многие болезнетворные микроорганизмы.

Микробиологические культуры стали огромным шагом вперед, но у них были свои ограничения. Например, бактерия, вызывающая туберкулез, растет очень медленно, поэтому выращивание культуры для диагностики инфекции может занимать недели. Многие другие грибки, паразиты и вирусы с трудом поддаются культивированию или не поддаются ему вообще. Появление в 1980-х годах полимеразной цепной реакции, или ПЦР-тестирования, позволило ученым создавать множество копий содержащихся в образце ДНК или РНК, что резко повысило чувствительность диагностических тестов. Но и при использовании этого метода врачи должны были заранее знать, что именно они ищут, и проверять каждый патоген по отдельности. Пациента с респираторными симптомами можно было проверить методом ПЦР на грипп, риновирус и респираторно-синцитиальный вирус, но, если все результаты оказывались отрицательными, причина болезни оставалась неизвестной.

Затем, в 2001 году, профессор биохимии Калифорнийского университета в Сан-Франциско Джо Деризи вместе с несколькими коллегами разработал устройство, которое они назвали ViroChip. Опираясь на исследования, проведенные им в аспирантуре Стэнфордского университета, Деризи запрограммировал робота наносить на стеклянные пластинки фрагменты ДНК всех вирусов, чьи геномы были полностью секвенированы. Когда ученые брали у пациента образец, содержащий вирус, помечали его флуоресцентным красителем и помещали на ViroChip, определенная точка на пластинке начинала светиться, показывая, что это за вирус. Чип мог помочь обнаруживать даже прежде неизвестные инфекции. В 2003 году Деризи использовал ViroChip, чтобы установить причину загадочной инфекционной вспышки в Восточной Азии: ею оказался новый коронавирус, позднее получивший название SARS-CoV. Сейчас его называют SARS-CoV-1, а вирус, вызывающий COVID-19, — SARS-CoV-2. Так Деризи убедился, что метагеномика способна преобразить диагностику.

Уилсон присоединился к лаборатории Деризи в Калифорнийском университете в 2013 году. Однажды профессор педиатрии из Висконсинского университета мимоходом рассказал им о четырнадцатилетнем мальчике с ослабленным иммунитетом, которого неоднократно госпитализировали с тяжелым менингоэнцефалитом. Агрессивное лечение не помогало, сообщил их коллега, а традиционные методы диагностики, включая биопсию мозга, не позволили выяснить причину болезни. Метагеномный анализ спинномозговой жидкости в итоге обнаружил Leptospira — бактерии, вызывающие лептоспироз. Вероятно, мальчик заразился во время купания в Пуэрто-Рико, куда приехал с миссионерской поездкой. В конце концов его вылечили внутривенным введением пенициллина. После этого команду завалили запросами от врачей, которым требовалась помощь с диагностикой. Деризи, Уилсон, их коллега Чарльз Чиу и еще несколько специалистов основали компанию Delve Bio, которая специализируется на метагеномном исследовании спинномозговой жидкости.

В мае я посетил здание из стекла и стали на окраине Бостона, где находится штаб-квартира Delve Bio на Восточном побережье США. В компанию только что доставили крошечную пластиковую пробирку со спинномозговой жидкостью пациента с неизвестной инфекцией или воспалительным заболеванием центральной нервной системы. Я наблюдал, как два техника в халатах и медицинских масках поместили пробирку в центрифугу, круглую машину, которая начала яростно ее трясти. Брэд Мюррей, генеральный директор Delve и один из ее основателей, сказал, что извлечение генетического материала любых грибков, которые могут находиться в образце, «похоже на попытку выковырять мякоть из грецкого ореха». Когда встряхивание закончилось, образец извлекли и подготовили к секвенированию. В секвенаторе, напоминавшем большой холодильник, за десять часов должны были идентифицировать миллионы коротких фрагментов нуклеиновых кислот. Затем данные загружали в облачную аналитическую систему, чтобы определить, не принадлежат ли какие-либо из этих фрагментов полностью секвенированным патогенам. На следующий день метагеномное исследование выявило в образце бактерию, против которой существовал новый антибиотик направленного действия, еще не испробованный лечащими врачами пациента.

Слушая рассказы Мюррея о случаях, которые помогла раскрыть Delve, я вновь подумал о невероятном разнообразии инфекционных заболеваний. У десятилетнего ребенка с таким же типом шунта, как у Кано, обнаружили новый вид Moraxella — бактерии, обычно обитающей в верхних дыхательных путях. У женщины старше шестидесяти лет, которая страдала спутанностью сознания и с трудом ходила, выявили нейроцистицеркоз — заболевание, при котором микроскопические личинки ленточного червя поселяются в головном мозге. В медицинской школе я заучивал списки таких патогенов, но, став врачом, редко встречал их в клинической практике. Вероятно, они не попали бы в мой список возможных диагнозов.

Возможности применения метагеномики выходят далеко за пределы медицины. Например, можно секвенировать всю ДНК в ложке воды из пруда, чтобы понять, какие виды там обитают. Если вы обнаружите инвазивные водоросли, то можете начать кампанию по очистке водоема; если найдете исчезающий вид лягушки — остановить застройку территории ради его спасения. Деризи рассказал, как несколько лет назад в заливе Сан-Франциско произошла массовая гибель леопардовых акул. Вскрытие показало обширные кровоизлияния в их мозг, что является признаком смерти от инфекции. Используя метагеномику, команда Деризи совместно с Калифорнийским управлением рыбных ресурсов и дикой природы установила виновника: Miamiensis avidus — паразита, который прежде не считался способным заражать леопардовых акул. Вероятно, он попал в залив со стоками после сильных дождей. «Прелесть подхода, не требующего предварительной гипотезы, — сказал Деризи, — состоит в том, что, столкнувшись с данными, вы не оказываетесь скованы когнитивными искажениями относительно того, в чем, как вам кажется, заключается проблема».

Разумеется, метод, оперирующий миллионами генетических фрагментов, создает и миллионы возможностей сделать ошибочный вывод. Шансинь Ян, клинический микробиолог из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, который изучает метагеномику уже пятнадцать лет, рассказал о пациенте с ослабленным иммунитетом. Ему назначили противогрибковые препараты после того, как метагеномный анализ крови обнаружил ДНК грибка. Лишь позднее врачи поняли, что генетический материал, вероятно, происходил из съеденного пациентом гриба, а не от болезнетворного микроорганизма. «Мы начинаем видеть множество вещей, которых не ожидали увидеть», — сказал Ян. Масштаб секвенирования и объем эталонных массивов данных затрудняют отделение надежного сигнала от шума. Наши тела заселены триллионами клеток, принадлежащих сотням видов микроорганизмов, и они могут появляться в результатах метагеномных тестов, даже если не причиняют никакого вреда. Крупное исследование, опубликованное в 2019 году, показало, что почти у двадцати трех процентов здоровых людей в крови присутствует микробная ДНК.

Патрисия Симнер, руководящая лабораторией молекулярной клинической микробиологии в клинике Майо, рассказала, что некоторые генетические библиотеки патогенов тщательно проверяются и редактируются ради точности, тогда как другие изобилуют ошибками. Например, в одном исследовании пяти тысяч здоровых людей ученые решили, что обнаружили пятьдесят видов бактерий, которые значительно чаще встречались у мужчин, чем у женщин. Но это открытие оказалось иллюзией: в эталонные последовательности бактерий по ошибке попали фрагменты человеческой Y-хромосомы. «Эти микробные справочные библиотеки огромны и постоянно меняются», — сказала Симнер.

Чувствительность метагеномного тестирования в значительной степени зависит и от типа исследуемого образца. Спинномозговая жидкость омывает головной и спинной мозг, поэтому особенно полезна для выявления инфекций в этих тканях. Метагеномные анализы крови, которые также становятся все более распространенными, не всегда дают однозначный результат: локализованные инфекции не обязательно проникают в кровоток. Когда Ян и его коллеги изучили результаты тысячи метагеномных анализов крови, они обнаружили, что полученные данные существенно улучшили лечение пациентов лишь в шестнадцати процентах случаев. Ишминдер Каур, доцент клинической педиатрии в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе и ведущий автор исследования, сказала, что метагеномный анализ не следует назначать автоматически. «Для подходящего пациента и в подходящей ситуации это хороший дополнительный тест, — сказала она. — Но он не заменяет получение образца ткани непосредственно из очага инфекции».

Ян беспокоится, что некоторые врачи относятся к метагеномике примерно так же, как к искусственному интеллекту: спешат внедрить технологию, не изучив должным образом ее ограничения. «Мы верим, что технологии способны решить все наши проблемы, — сказал он. — Это сильно отличается от того, как было раньше, когда мы сначала изучали технологию и только потом начинали ею пользоваться». Опасность заключается в том, что врачи могут воспринимать результаты метагеномных тестов как окончательную истину, а не как то, чем они являются на самом деле: еще один набор данных, который требует интерпретации.

Впрочем, все эти опасения нисколько не ослабили энтузиазм Яна в отношении метагеномики. Потенциал технологии проявился этой весной, когда метагеномика помогла установить причину заболевания на борту круизного судна M.V. Hondius: ею оказался андский хантавирус. Примерно в то же время больницы провинции Итури в Демократической Республике Конго начали заполняться пациентами с высокой температурой, диареей и рвотой. Тесты на малярию и брюшной тиф дали отрицательные результаты, как и ПЦР-тесты на распространенный заирский штамм вируса Эбола. Лишь через несколько недель, в середине мая, врачи отправили образцы пациентов в Киншасу, столицу ДРК, для метагеномного анализа. За шестнадцать часов секвенирование выявило вирус, от которого заболели люди: вариант Бундибуджио вируса Эбола. Проблема заключалась не в том, что ПЦР-тесты оказались неверными: в конце концов, у пациентов действительно не было того штамма Эболы, на который их проверяли. Проблема, по всей видимости, состояла в том, что пациентам сделали не тот тест. 

Источник

Присоединяйтесь к нашему каналу в Telegram! Не надоедаем лишними уведомлениями